De twee grootste namen in de wereld van videospellen ontmoeten elkaar op het grootste podium ter wereld voor een ultieme beproeving van vaardigheid, uithoudingsvermogen en sportiviteit. Mario & Sonic op de Olympische Spelen brengt bewoners van het Mushroom Kingdom en het Sonic-universum samen om het tegen elkaar op te nemen in 20 olympische evenementen, van baansport tot zwem- en schietsporten. De 16 personages worden op basis van hun bekwaamheid onderverdeeld in vier groepen. Sonic en Yoshi maken deel uit van de snelheidsgroep, Mario en Amy Rose zijn allround atleten, Peach en Tails neigen naar de technische kant en Bowser en Knuckles moeten het volledig van hun kracht hebben.